SPEKTROFOTOMETER
Spektrofotometer
sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spectrometer dan fotometer.
Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu
dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di transmisikan atau
yang di absorpsi.
Spektrofotometri merupakan bagian dari
fotometri dan dapat dibedakan dari filter fotometri sebagai berikut :
·
Sumber radiasi
Sumber yang
biasa digunakan lampu hidrogen atau
deuterium untuk pengukuran UV dan lampu tungsten untuk pengukuran cahaya
tampak.
·
Monokromator
Digunakan
untuk memperoleh sumber sinar yang monokromatis. Alatnya berupa prisma
ataupun grating. untuk mengarahkan sinar
monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian dapat digunakan celah
·
Sel / Kuvet
Pada
pengukuran di daerah sinar tampak kuvet kaca dapat digunakan, tetapi untuk
pengukuran pada daerah UV kita harus menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak
tembus cahaya pada daerah ini. Umumnya tebal kuvetnya adalah 1 cm, tetapi yang
lebih kecil ataupun yang lebih besar dapat digunakan.
·
Detektor
Peranan
detektor adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang
gelombang.
Pada umumnya ada beberapa jenis
spektrofotometri yang sering digunakan dalam analisis secara kimiawi, antara
lain:
a. Spektrofotometri
UV (ultra violet)
b. Spektrofotometri
Vis (visibel)
c. Spektrofotometer
UV-VIS
Spektrofotometri
UV adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul
atau atom dari suatu zat kimia. Jangkauan panjang gelombang untuk daerah
ultraviolet adalah 190-380 nm. Sebagai sumber sinar
dapat digunakan lampu deuterium.Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia
merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan
daratan.
Inti
atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya
memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari
bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki
dua pertikel.Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa
yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki
warna. Bening dan transparan.Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu
dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat
langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh
tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi.Spektrofotometri UV memang lebih simple dan
mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi
sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi
interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang
gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
Sinar
ultraviolet terbagi menjadi 2 jenis yaitu ultraviolet jauh dan ultraviolet
dekat. Ultraviolet jauh memiliki rentang panjang gelombang ± 10-200 nm,
sedangkan ultraviolet dekat memilki rentang panjang gelombang ± 200-400 nm. Zat
yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri UV adalah zat dalam bentuk
larutan dan zat tersebut tidak berwarna. Senyawa-senyawa organik sebagian besar
tidak berwarna sehingga spektrofotometer UV lebih banyak digunakan dalam
analisis senyawa organik khususnya dalam penentuan struktur senyawa organik.
Radiasi
ultraviolet diabsorpsi oleh
molekul organik aromatik, molekul yang mengandung π terkonjugasi dan atau atom
yang mengandung elektron –n, menyebabkan transisi elektron di orbital
terluarnya dari tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron
tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan
banyaknya molekul analit yang mengasorpsi sehingga dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif.
Gugus fungsi
yang menyerap radiasi di daerah ultraviolet dekat dan daerah tampak disebut
khromofor dan hampir semua khromofor mempunyai ikatan tak jenuh. Pada khromofor
jenis ini transisi terjadi dari π π*,
yang meyerap pada λmaks kecil dari 200 nm (tidak terkonjugasi),
misalnya pada >C=C< dan -C≡C-. Khromofor ini merupakan tipe transisi dari
sistem yang mengandung elektron π pada orbital molekulnya. Untuk senyawa yang
mempunyai sistem konjugasi, perbedaan energi antara keadaan dasar dan keadaan
tereksitasi menjadi lebih kecil sehingga penyerapan terjadi pada panjang
gelombang yang lebih besar.
Gugus fungsi
seperti –OH. –NH2, dan –Cl yang mempunyai elektron-elektron valensi bukan
ikatan disebut auksokhrom yang tidak menyerap radiasi pada panjang gelombang
lebih besar dari 200 nm, tetapi menyerap kuat pada ultraviolet jauh. Bila suatu
auksokhrom mengikat pada suatu khromofor, maka pita serapan khromofor bergeser
ke panjang gelombang yang lebih panjang (efek batokhrom) dengan intensitas yang
lebih kuat. Efek hipsokhrom adalah suatu pergeseran pita serapan ke panjang
gelombang yang lebih pendek yang sering terjadi bila muatan positif dimasukan
kedalam molekul dan bila pelarut berubah dari non polar ke pelarut polar.
B.
Spektrofotometri
Visibel
Pada
spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya
tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat
ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai
750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih,
merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar
tersebut termasuk ke dalam sinar tampak(visible).
Sumber sinar
tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten.
Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia
dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi
(3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan
sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa
dengan metode ini hanya sample yang memiliki warna. Oleh karena itu, untuk
sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan
menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent
yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analit yang
akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan stabil.
biasanya pengujian menggunakan reagent pewarna mempunyai waktu maksimal untuk
mengukur agar valid. salah satu contoh analisa dengan dtektor Visible adalah Cr6+
yang menggunakan pereaksi 2- diphenil carbazide menghasilkan warna ungu.
C.
Spektrofotometri Ultraviolet (UV) Dan Visibel (VIS)
Radiasi elektromagnetik
adalah energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Sinar ultraviolet (UV) dan
sinar tampak (visibel/vis) merupakan contoh radiasi elektromagnetik tersebut.
Ada beberapa istilah yang terlebih dahulu harus diketahui sehubungan dengan
radiasi elektromagnetik ini, diantaranya panjang gelombang, frekuensi dan
energi. Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu
gelombang ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan.
Dimensi
panjang gelombang dapat dinyatakan dalam berbagai satuan panjang seperti
sentimeter (cm), mikrometer (µm), nanometer (nm), dan angstrom (Å).
1 angstrom = 10-8 cm
1 nanometer = 10-7 cm
1 angstrom = 10-8 cm
1 nanometer = 10-7 cm
Satuan nm
merupakan satuan yang paling sering digunakan untuk menyatakan panjang
gelombang. Lambda (λ) merupakan simbol yang umum digunakan untuk menotasikan
panjang gelombang. Sedangkan frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang
melewati suatu titik tertentu dalam satuan waktu.Hubungan kuantitatif antara
energi yang dimiliki oleh suatu radiasi elektromagnetik, frekuensi dan panjang
gelombang dapat dituliskan dengan persamaan:
E = h.v.......................(1)
v = c/λ.......................(2)
Dari persamaan 1 dan 2 diatas dapat diperoleh persamaan
E = hc/λ
dimana:
E = energi radiasi
h = tetapan planck (6,626 x 10-34 joule)
c = kecepatan cahaya yang nilainya 2,998 x 1010 cms-1
λ = panjang gelombang
Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sedangkan sinar tampak mempunyai penjang gelombang antara 400-750 nm.
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak. Radiasi monokromatik hanya akan menghasilkan satu sinar tampak.
E = h.v.......................(1)
v = c/λ.......................(2)
Dari persamaan 1 dan 2 diatas dapat diperoleh persamaan
E = hc/λ
dimana:
E = energi radiasi
h = tetapan planck (6,626 x 10-34 joule)
c = kecepatan cahaya yang nilainya 2,998 x 1010 cms-1
λ = panjang gelombang
Sinar ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, sedangkan sinar tampak mempunyai penjang gelombang antara 400-750 nm.
Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya. Sinar putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar tampak. Radiasi monokromatik hanya akan menghasilkan satu sinar tampak.
Penyerapan Radiasi Oleh Molekul
Semua molekul mempunyai
energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa fenomena. Setiap molekul dapat
bergerak:
§ Gerak
translasi, yaitu gerakan yang terjadi dimana suatu molekul bergerak secara
keseluruhan. Energi yang berhubungan dengan gerak translasi disebut energi
translasional (Etrans)
§ Gerak
vibrasi, yaitu gerakan dilakukan oleh sebagian dari molekul ( atom atau
sekelompok atom). Energi yang berhubungan dengn gerak vibrasi disebut energi
vibrasional (Evib)
§ Molekul
dapat berotasi pada sumbunya dan rotasi ini dikarakterisasi dengan energi
rotasional (Erot )
§ Suatu
molekul juga memiliki konfigurasi elektronik yang besarnya energi elektronik (Eelek)
ini tergantung pada keadaan elektronik molekul.
Energi suatu molekul merupakan hasil
penjumlahan dari semua energi tersebut:
E = Etrans
+ Evib + Erot + Eelek
Komponen-komponen
energi tersebut dapat dianggap memiliki nilai tertentu dan dikatakan
terkuantisasi. Level energi suatu molekul berhubungan erat dengan struktur
molekulnya. Hampir tidak 2 molekul yang memiliki energi vibrasional, rotasional
dan elektronik yang identik.
Jika suatu molekul
bergerak dari suatu tingkat energi ke tingkat energi yang lebih rendah
maka beberapa energi akan dilepaskan. Energi tersebut dapat hilang sebagai
radiasi dan dapat dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul
dikenai radiasi elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul
tersebut ditingkatkan ke tingkat energi yang lebih tinggi, maka terjadi
peristiwa penyerapan (absorpsi) energi oleh molekul. Agar terjadi absorpsi,
perbedaan energi antara dua tingkat energi harus setara dengan energi foton
yang diserap, atau sesuai persamaan:
E2 - E1 = hv
dimana:
E1 = Energi pada tingkat yang lebih
rendah
E2 = Energi pada tingkat yang lebih
tinggi
v = frekuensi foton yang
diabsorpsi
Banyaknya radiasi yang diserap oleh
suatu molekul dapat diukur. Grafik yang menghubungkan antara banyaknya sinar
yang diserap dengan frekuensi ( atau panjang gelombang) sinar disebut spektrum
absorpsi (jamak; spektra). Transisi yang dibolehkan untuk suatu molekul dengan
struktur kimia tertentu akan berbeda dari molekul lainnya, sehingga spektrum
serapannya juga berbeda. Dengan demikian spektrum serapan molekul ini dapat
dijadikan sebagai informasi analisis. Banyaknya sinar yang diabsorpsi sebanding
dengan banyaknya molekul yang menyerap radiasi, sehingga spektrum absorpsi
dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Kromofor merupakan semua gugus atau atom
dlaam senyawa organik yang mampu menyearp sinar ultraviolet atau sinat tampak.
Kromofor ini ditandai dengan adanya gugus alkena, alkun, karbonil, karboksil,
amido, azo, nitro, nitroso dan nitrat. Selain adanya kromofor, pada molekul
organik juga dikenal istilah auksokrom yang merupakan gugus fungsional yang
mempunya pasangan elektron bebas/elektron menyendiri/elektron yang tak
berikatan, seperti: -OH, -O, -NH2 dan lain-lain.
Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis
Spektrum serapan UV-vis
dapat digunakan dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif.
A. Aspek Kualitatif
Data spektrum serapan UV-Vis tersendiri
tidak dapat digunakan untuk keperluan identifikasi kualitatif suatu molekul
obat maupun metabolitnya. Namun bila data tersebut digabungkan dengan metode
lainnya seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnetik inti, atau
spektroskopi massa maka akan dapat digunakan untuk keperluan identifikasi senyawa.
Data yang diperoleh dari spektrofotometri UV-Vis adalah:
·
panjang gelombang
serapan maksimum
·
intensitas
·
efek pH
·
dan pelarut
dimana data tersebut dapat digunakan
dalam analisis dengan membandingkannya dengan data literatur. Dari data
spektrum dapat diketahui:
Apakah serapan berubah atau tidak akibat
adanya perubahan pH. Lebih lanjut jika perubahan terjadi apakah perubahannya
bersifat batokromik, hipsokromik, hipokromik atau hiperkromik.
Apakah molekul bersifat
netral (misal; kafein, kloramfenikol) atau mengandung auksokrom (misal;
amfetamin, siklizin)
B.
Aspek Kuantitatif
Intensitas atau
kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan
luas penampang persatuan waktu. Hubungan kuantitatif spektrum serapan molekul
dapat ditulis dengan persamaan:
A = abc
dimana:
A = absorban
a = absorptivitas
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Persamaan diatas dikenal dengan hukum Lambert-Beer.
Absorptivitas merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi,
tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Absorptivitas
tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi.
Hukum Lambert-Beer berlaku
jika:
·
Sinar yang digunakan
dianggap monokromatis
·
Penyerapan terjadi pada
suatu volume yang mempunyai penampang luas yang sama
·
Senyawa yang menyerap
dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap komponen lain dalam larutan
tersebut
·
Tidak terjadi
fluoresensi atau fosforisasi
·
Indeks bias tidak
tergantung pada konsentrasi larutan
Dalam analisis kuantitatif,
spektrofotometri UV-Vis dapat digunakan dalam analisis zat tunggal (satu
komponen) atau pun untuk analisis campuran 2 atau lebih zat (multi komponen).
Hal-hal yang Harus Diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometri UV-Vis
Dengan
menggunakan spektrofotometri UV-Vis dalam analisis, ada beberapa hal yang harus
diperhatikan. Terutama bila analisis dilakukan terhadap zat-zat yang yang tak
berwarna dan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel, maka
zat tersebut terlebih dahulu harus direaksikan menjadi zat yang berwarna.
Pembentukan Molekul yang Dapat Menyerap Sinar UV-Vis
Pengubahan suatu molekul menjadi molekul lain yang dapat menyerap didaerah UV atau visibel perlu dilakukan terutama bila molekul tersebut tidak menyerap didaerah UV atau visibel. Cara yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah mereaksikan molekul tersebut dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi persyaratan berikut:
Pembentukan Molekul yang Dapat Menyerap Sinar UV-Vis
Pengubahan suatu molekul menjadi molekul lain yang dapat menyerap didaerah UV atau visibel perlu dilakukan terutama bila molekul tersebut tidak menyerap didaerah UV atau visibel. Cara yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah mereaksikan molekul tersebut dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi persyaratan berikut:
·
Reaksinya selektif dan
sensitif
·
Reaksinya cepat,
kuantitatif dan reprodusibel
·
Hasil reaksi stabil
dalam jangka waktu yang lama
Keselektifan suaru pereaksi
dapat dinaikan dengan cara melakukan pengaturan pH, pemakaian masking agent,
atau penggunaan teknik ekstraksi. Naftil etilen diamin (NED) adalah contoh
pereaksi yang sering digunakan untuk mereaksikan obat-obat golongan sulfonamida
melalui reaksi diazotasi menghasilkan suatu molekul yang berwarna sehingga
dapat dianalisis dengan menggunakan spektrofotometri visibel.
Waktu Operasional
Cara ini biasa
digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya
adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional
ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi
larutan.
Pada saat awal terjadi
reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat sampai waktu tertentu
hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka
ada kemungkinan senyawa berwarna tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga
intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun. Karena alasan
itulah maka pengukuran senyawa berwarna yang dihasilkan dari suatu reaksi harus
dilakukan pada saat waktu operasional.
Pemilihan Panjang Gelombang
Panjang gelombang yang
digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang serapan maksimum.
Panjang gelombang serapan maksimum ini dipilih karena:
Pada panjang gelombang
serapan maksimum, kepekaannya juga maksimum karena pada panjang gelombang
tersebut perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang
paling besar.
Disekitar panjang
gelombang serapan maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi
tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
Jika dilakukan
pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang
gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang serapan
maksimum.
Pembuatan Kurva Baku
Kurva baku dibuat dari
pengukuran satu seri larutan baku zat yang akan dianalisis. Masing-masing
larutan baku tersebut kemudian diukur absorbansinya, kemudian dibuat kurva yang
merupakan hubungan absorbansi (y) dengan konsentrasi (x). Hukum Lambert-Beer
terpenuhi bila kurva berbentuk garis lurus.
Klasifikasi sinar tampak beserta warna komplementernya yaitu
sebagai berikut :
Panjang
gelombang (nm)
|
Warna
|
Warna
komplementer
|
400-435
|
Violet/ungu/lembayung
|
Hijau kekuningan
|
435-480
|
Biru
|
Kuning
|
480-490
|
Biru kehijauan
|
Jingga
|
490-500
|
Hijau kebiruan
|
Merah
|
500-560
|
Hijau
|
Ungu kebiruan
|
560-580
|
Hijau kekuningan
|
Ungu
|
580-610
|
Jingga
|
Biru kehijauan
|
610-680
|
Merah
|
Hijau kebiruan
|
680-800
|
Ungu kemerah-merahan
|
Hijau
|
Tugas
2, lanjutan :
untuk membuat larutan standar glukosa
3 ml/ 100 ml glukosa
dengan larutan standar 100 ppm menggunakan rumus V1 x M1 = V2 x M2
dimana V2 = 3 ml
(glukosa standar)
M2= 100 ppm (larutan standar)
M1= 100 ml aquades
Sehingga jika
dibutuhkan larutan standar 100 ppm maka
dapat dihitung sbb:
V1 x M1 = V2 x
M2
V1 x 100 = 3 ml
x 100 ppm
V1 =
V1 = 3 ml
(banyaknya larutan standar yang dibutuhkan)
Tugas 2 lanjutan :
Pembuatanlarutan Standar glukosa glukosa 10 mg dilarutkan dengan Aquades dalam labu takar 100
ml, hingga diperoleh larutan standar 100 ppm maka digunakan rumus
pengenceran
V1 x M1 = V2 x
M2
V1 x 100 ml = 10 mg x 100 ppm
V1 =
V1 = 10 mg
Jika dikonversikan kedalam gram dengan menggunakan rumus dan cara
perhitungan yang sama maka diperoleh glukosa standar V1 = 0.01 g / 100 ml aquades dengan larutan
standar 100 ppm.
MGM Resorts Casino $250M expansion coming to Michigan, but
BalasHapusMGM Resorts Casino 거제 출장안마 in 김제 출장마사지 Maricopa announced today it has officially MGM Resorts will be adding 대전광역 출장마사지 a 익산 출장마사지 temporary sportsbook and bar to its gaming floor 충청남도 출장샵