Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Uji Fisiologis Mikroba

LAPORAN  PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PANGAN

“Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Uji Fisiologis Mikroba”

 

 

OLEH

HASBI

D1C1 12 012

  

I.PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi  bakteri.

Banyak metode atau tahapan standar yang dilakukan dalammengidentifikasi mikroba, salah satunya berdasarkan sifat kimiawinya. Sel terdiridari berbagai bahan kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka selini memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh disini adalah bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimanasel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitumengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif

Melihat dari berbagai devinisi yang telah disebutkan diatas maka kami sangat tertarik untuk melakukan pengujian guna untuk mengidentifikasi dan mengetahui morfologi dari bakteri utamanya pada bakteri yang ber gram positif dan gram negatif serta dapat mengetahui morfologi bakteri aerob dan anaerob dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba.

B. Tujuan dan Manfaat

            Tujuan dilakukannya praktikum pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba adalah untuk mengidentifikasi mikroba pada bahan pangan dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis.

Manfaat dari praktikum ini adalah praktikan manpu mengidentifikasi jenis mikroba dengan cara pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji katalase (Subandi, 2009).

Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu bakteri. Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat, sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol. Pewarnaan spora dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya spora pada bakteri. Spora dapat terbentuk saat kondisi tidak memungkinkan pertumbuhan bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih cepat dan sukar melepaskannya (Fardiaz 1989).

Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas obyek sehingga membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet olesan bakteri digenangi selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes sampai zat warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikeringanginkan. Kemudian dogenangi lagi dengna safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan kering diudara. Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif dan jika warna ungu menunjukkan bakteri gram positif (Michael, 2008).

Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi aerob dan anaerob. Perbedaan utama antara kedua adalah kenyataan bahwa bakteri aerobik membutuhkan oksigen untuk tetap hidup, sementara bakteri anaerob tidak bergantung pada oksigen untuk proses metabolisme dan kelangsungan hidup. Sedangkan aerob dapat berkembang di habitat yang memiliki oksigen berlimpah, anaerob dapat mati dalam dengan adanya oksigen. Jenis bakteri memang memiliki keunggulan pertumbuhan area tubuh tidak terpapar oksigen, dan mereka bisa menjadi patogen virulen. Perbedaan kapasitas untuk memanfaatkan oksigen antara aerob dan anaerob penting dalam pengobatan infeksi tubuh (Lay, 1994)

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu, identifikasi juga dapat dilakukan dengan penguraian sifat patogenitas dan serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda. Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas ,tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan ekteri (Ratna,1990).

Pada umumnya jarang atau tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan adanya lendir atau tidak meskipun beberapa kultur bereaksi secara lambat. Namun jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya akan salah. Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam. Metode ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu.Dari uraian tersebut, dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:

1.      Tidak dapat sekaligus mengecek morfologi selnya sehingga tidak dapat mengetahui adanya kontaminan pada kultur yang tidak diketahui jenisnya.

2.      Kultur (sel) yang digunakan lebih banyak daripada pewarnaan gram. Hal ini akan menimbulkan masalah jika bakteri uji memiliki koloni tunggal yang kecil dan adapula yang merekat dengan agar.

3.      Tidak dapat mendeteksi gram variabel (telah dijelaskan).

Ø  Lalu bagaimana bisa berlendir.

Secara teoretis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum (Edwin, 2011). 

III. METODOLOGI PRAKTIKUM

A. Waktu dan Tempat

Praktikum Pewarnaan Gram, Uji KOH dan Uji Fisiologis Mikroba ini dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 11 November 2013 pukul 13.00 – 15.30 WITA dan bertempat di Laboratorium Agroteknologi Unit Ilmu Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Halu Oleo Kendari.

B. Alat dan Bahan

            Alat yang digunakan pada praktikum pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba adalah gelas objek, jarum ose, bunsen, pipet mikro, dan tabung reaksi.

            Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri, tissu, alkohol, larutan KOH 3%, larutan hucker’s ammonium oxalate cristal violet (Gram A), larytan mordan lugol iodine (Gram B) dan dekolorizer (Gram C), bahan kimia media pertumbuhan anaerob (pepton 2g, NaCl 5g, KH₂PO₄ 0,3g, bromothymol blue (1%) 3,0g), isolat bakteri uji, aquades steril, larutan glukosa dan prafin cair.

C. Prosedur Kerja

            Prosedur kerja yang dilakukan  pada praktikum pewarnaan gram, uji KOH dan uji fisiologis mikroba adalah:

1. Uji Larutan KOH

a)      Mengambil satu ose biakan bakteri menguji dan mencampurkan dengan 2 tetes larutan KOH 3%  di atas gelas objek

b)      Mengaduk secara merata dengan jarum ose, menari jarum ose keatas gelas objek dan mengamati pembentukan lendir. Jika terbentuk lendir mengindikasikan bakteri gram negatif, jika tidak berlendir mengindikasi bakteri gram positif

c)      Melakukan hal yang sama seperti pada prosedur satu dan dua untuk isolat-iosolat bakteri lainnya

2. Uji Pertumbuhan Aerob dan Anaerob

a)      Mencampurkan semua bahan media anaerob dan menetapkan pH nya menjadi 7,1. Memasukkan kedalam tabung reaksi, ketinggian media sekitar 13 cm, sterilisasi pada suhu 121º C selama 20 menit.

b)      Menyiapkan larutan glukosa 10% dan menyaring dengan filter sterilisasi

c)      Menambahkan 0,5 ml larutan glukosa 10% dalam media anaerob sebelum media membeku

d)     Setelah media membeku, meninokulasi bakteri uji (umur 48 jam) dengan menggunakan jarum ose kedalam media. Satu isolat bakteri diinokulasi pada dua tabung,  satu tabung ditutup dengan vaselin atau farafin cair steril setinggi 5 cm

e)      Menginkubasi selama 3-4 hari, dan mengamati perubahan warna pada media. Perubahan warna dari biru menjadi kuning pada media yang ditutup dengan vaselin menunjukkan bahwa isolat tersebut positif mampu hidup secara anaerob.

3. Uji Proteolitik

a)      Menginokulasikan bakteri uji pada  nutrien agar yang mengandung skim milk 2% , inkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam.

b)      Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih disekeliling koloni

4. Uji Degradasi Amilum

a)       Menginokulasikan bakteri uji pada  nutrien agar yang mengandung pati  2% , inkubasi pada suhu 37ºC selama 48 jam.

b)      Aktivitas degradasi amilum ditunjukkan oleh terbentuknya zone jernih disekeliling koloni.

 HASIL DAN PEMBAHASAN

 ( hasil dan pembahasan di buat sendiri ya sobbbb ckckc)

V. PENUTUP

A. Kesimpulan

            Gram  memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram  berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram.

Semua bakteri memiliki enzim proteinase tapi tidak semuanya memiliki enzim proteinase ekstraseluler, aktivitas enzim ini juga dapat dibuktikan dengan adanya zona bening di sekeliling koloni. Jenis bakteri yang dapat menghidrolisis protein adalah bakteri yang memproduksi enzim proteinase ekstraseluler

B. Saran

            pada praktikum ini banyak prosedur yang harus dilakukan secara teliti dan tepat, sehingga disarankan agar setiap perlakuan dilakukan sesuai rosedur dan aturan- aturan agar hasil pengamatan sesuai dengan yang diharapkan.

DAFTAR PUSTAKA

Edwin. 2011. Materi Kuliah Mikrobiologi. Universitas Lambung Mangkurat,          Banjarbaru.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB, Bogor.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Pt.Gramedia,   Jakarta

Lay, Bibiana W.,1994.Analisis mikroba di laboratorium. PT. Raja Grafindo, Jakarta.

Michael J. Pelczar, dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Ui-Press,    Jakarta

Subandi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press,Bandung.